流动化学 + 固定化转氨酶！绿色高效手性哌啶合成新方案

手性含氮杂环是药物分子、农用化学品、精细化工中间体的核心骨架，其中2,6 - 二取代手性哌啶广泛存在生物碱、抗过敏、抗癌药物结构中。传统化学合成路线步骤冗长、保护基繁琐、立体选择性差；游离酶催化又存在催化剂难回收、批次反应效率低、副产物难控制等痛点。

近期《Advanced Synthesis & Catalysis》发表意大利米兰大学、意大利国家化学技术研究所联合团队重磅成果：将固定化 ATA-117 转氨酶与连续流反应器结合，开发一套化学 - 酶耦合流动合成体系，实现天然生物碱 (-)- 匹尼酮 ((–)-pinidinone) 及系列多取代顺式 (2R,6R)- 哌啶绿色、可放大制备，兼顾高转化率、优异非对映选择性与催化剂重复利用性，为手性氮杂环工业化生物催化提供全新思路。

一、研究背景：手性哌啶合成的行业痛点

1.药物刚需，但传统合成短板突出吗啡、阿托品、各类抗组胺、抗肿瘤药物均含哌啶环；手性直接决定药效、毒副作用。现有合成路线：吡啶不对称加氢、曼尼希串联、有机催化环化，普遍依赖贵金属催化剂、严苛高温高压，分离成本高。 生物催化中转氨酶（ω-TA）是手性胺合成明星酶，依靠 PLP 辅酶实现高对映选择性胺化，但游离酶存在三大硬伤：无法回收、批次反应耗时久、难以对接连续化生产线

2.天然产物 (-)- 匹尼酮合成现存难题 (-)- 匹尼酮是松属植物来源生物碱，兼具抗菌、抗炎、神经调节活性。已报道全合成路线多需多步保护 - 脱保护，总收率低、非对映异构体难以拆分；前人虽开发游离 ATA-117 一锅转氨 / 氮杂迈克尔环化路线，但仅局限间歇小试，无法规模化。

3.本研究核心目标

1.       构建可回收固定化 ATA-117 生物催化剂；

2.       搭建连续流反应系统，解决游离酶副产物累积、反应慢问题；

3.       开发双路进料工艺抑制亚胺、迈克尔加成副产物；

4.       拓展底物适用范围，兼容芳基、羧酸酯取代哌啶衍生物；

5.       配套在线后处理，实现全流程自动化、降低人工操作。

二、核心实验突破：从间歇酶优化到连续流成套工艺

（一）游离重组 ATA-117 间歇体系系统筛选

团队在大肠杆菌中异源表达带 His 标签 ATA-117，对比商业冻干粗酶、纯化重组酶、细胞裂解粗酶活性差异：

1.       纯化酶间歇条件：底物 50 mM、异丙胺 (IPA) 750 mM、PLP 1 mM、酶浓度 2 mg/mL、10% DMSO 助溶，30 ℃仅 5 h 实现底物转化；

2.       细胞裂解粗酶活性大幅衰减，48 h 才转化完成，证明纯化酶是固定化合适原料；

3.       间歇反应产物非对映比仅 8:2（顺式：反式），后续无需差向异构即可通过流动工艺大幅提升选择性。

（二）两种载体酶固定化对比，Eupergit C 综合性能好

研究选用两种主流固定化载体，对比负载率、活性回收率、稳定性：

1.       Eupergit C（环氧共价固定） 负载量 40 mg 酶 /g 载体，固定化率＞99%；活性回收率 18%；优势：共价结合无酶泄漏，耐缓冲、可多次循环。

2.       EziG Amber（金属亲和固定，结合 His 标签） 固定化率 88%，活性回收率 19%；短板：同等底物浓度下反应速率远低于 Eupergit C 固定酶，10 mM 底物需 96 h 转化完成。

固定化酶稳定性测试

·       操作循环稳定性：10 mM 底物间歇循环反应，前 4 轮转化率接近 100%，第 9–10 轮活性下降约 50%，副产物增多；

·       储存稳定性：4 ℃冷藏 1 个月，每周检测催化活性，全程保持 99% 底物转化，储存稳定性优异。

（三）连续流反应器迭代：单路进料缺陷→双路分流进料解副反应

1. 初代单一进料（底物 + IPA 预混）致命缺陷

底物烯二酮与高浓度异丙胺提前在管路发生非酶促反应，生成大量亚胺中间体、烯酮 - IPA 迈克尔加合物副产物；合适条件底物转化率仅 59%，目标顺式哌啶产物占比不足 25%，大量原料被副反应消耗，不具备应用价值。

2. 创新双泵分流进料体系（核心创新点）

两路溶液在进入酶填充床前 T 型接头瞬时混合：一路含底物 + PLP 缓冲液，另一路单独输送异丙胺溶液，极大缩短底物与高浓度氨基供体预接触时间，从源头抑制非酶促副反应。

连续流条件优化关键数据（合适工艺）

·       底物浓度 20 mM，IPA 200 mM（10 当量）；

·       温度 30 ℃，停留时间 60 min；

·       双路等流速泵送，总流速 16.8 μL/min；

·       底物转化完成，产物顺式 (2R,6R): 反式 = 98:2，非对映纯度 96% de，远超间歇反应；

·       升温至 40 ℃可提升转化，但需背压阀抑制异丙胺挥发，综合能耗选择 30 ℃更可持续。

（四）自动化在线后处理，打通制备级放大链路

在流动反应柱后端集成连续萃取模块：在线通入 NaOH 调碱、乙酸乙酯两相萃取，搭配 Zaiput 连续分相器，有机相直接收集浓缩，省去批次繁琐调 pH、分液操作，大幅降低人工干预，适配长期连续运行。

三、工艺优势：流动生物催化 VS 传统间歇酶反应

表格

制备级放大实验：装填 1.3 g 固定化酶，1 mL 填充床反应器，连续运行 32 h，粗 (-)- 匹尼酮收率 94%，柱层析纯化后单一立体异构体，对映过量 ee=97%；催化剂出料后复测活性，仍可实现底物转化完成。

四、底物拓展：通用型平台适配多类 2,6 - 二取代哌啶

团队基于相同流动催化体系，合成 5 类不同骨架手性顺式哌啶：

1.       (-)- 匹尼酮（烷基酮侧链，天然生物碱）；

2.       苯基取代哌啶酮（芳基药用中间体）；

3.       甲酯、苄酯、叔丁酯取代 γ- 氨基哌啶（氨基酸类药物砌块）；

全部底物均实现高顺式选择性，粗产物反式异构体含量＜2%，简单闪柱层析即可分离纯品，证明该固定化酶 - 连续流平台具备普适性，不受侧链酯基、芳基、烷基结构限制。

五、研究总结与行业价值

1. 核心创新亮点

1.       将固定化 ω- 转氨酶 ATA-117 与双路进料连续流耦合，实现天然 (-)- 匹尼酮化学 - 酶一体化合成；

2.       提出分流进料策略，从根源解决胺供体与烯酮底物提前发生副反应的行业难题；

3.       共价固定化酶兼具优异储存与循环稳定性，比间歇游离酶生产效率提升 4.6 倍；

4.       集成在线连续萃取，构建全自动化、可放大手性氮杂环合成流水线；

5.       底物适用范围广，覆盖生物碱、芳基酮、氨基酯类高价值药物中间体。

2. 工业化与绿色合成意义

·       绿色低碳：酶催化温和常温水环境，避免重金属、强氧化还原试剂，三废大幅减少；

·       成本可控：固定化酶反复使用，降低酶制剂单次生产成本；连续流占地小、批次重复性高；

·       药物合成赋能：快速构建高立体纯度 2,6 - 二取代哌啶骨架，简化生物碱、手性 API 中间体生产路线，缩短研发与中试周期。

3. 未来展望

该流动生物催化框架可拓展至其他转氨酶、还原酶复合串联催化；通过载体改性进一步提升酶活性回收率；放大填充床体积、优化流速，推进公斤级药物中间体连续化生产，为生物制造替代传统高污染化学合成提供成熟范本。